How to perform a CRISPR knockout experiment?

En comparación con los métodos tradicionales de selección de genes, una de las principales ventajas de la tecnología CRISPR es que el gRNA y el complejo Cas9 expresados ​​de forma estable explorarán continuamente el genoma y generarán roturas de doble hebra específicas hasta que todos los sitios objetivo se hayan eliminado o mutado. El sistema de expresión estable CRISPR se ha utilizado con éxito para eliminar los genes de la familia A2 multicopia que tienen más de 11 copias distribuidas en cuatro grupos en el cromosoma 22 de los   parásitos L. donovani 1SCL2D [ ]. Para eliminar genes de la familia de copias múltiples, es posible usar un solo ARNg dirigido al gen internamente (Fig.  ) O dos ARNg, uno dirigido a la secuencia flanqueante 5 'del grupo de genes y el otro a la secuencia flanqueante 3' ( Higo. ). Un tiempo de cultivo prolongado y el uso de un donante de oligonucleótidos o un donante de marcadores de selección de fármacos aumentarán la eficacia de la selección de genes como diana de múltiples copias.

Referencias

• Zhang WW, Lypaczewski P, Matlashewski G (2017) Edición optimizada del genoma CRISPR-Cas9 para Leishmania y su uso para apuntar a una familia multigénica, inducir la translocación cromosómica y estudiar los mecanismos de reparación de rotura del ADN. mSphere 2 (1): e00340 – e00316. https://doi.org/10.1128/mSphere.00340-16